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              董夢秋實驗室爲交聯質譜技術再添利器

              發布時間:2019/09/07

              董夢秋實驗室與合作者近期在《Nature Communications》雜志上連續發表了兩篇論文,不斷提升基于質譜的蛋白質結構分析技術。文章的題目分別是 “Improving mass spectrometry analysis of protein structures with arginine-selective chemical cross-linkers” 和 “A high-speed search engine pLink 2 with systematic evaluation for proteome-scale identification of cross-linked peptides”。前者介紹了新型精氨酸特異性交聯劑ArGO和精氨酸/賴氨酸雙選擇性交聯劑KArGO的開發和應用,2019 年9月2日發表;後者介紹了快速精准的新一代交聯鑒定軟件pLink 2以及完整、客觀的軟件評測方案,2019 年7月30日發表。


              董夢秋實驗室一直致力于開發和完善交聯質譜技術(英文全稱Chemical cross-linking of proteins coupled with mass spectrometry, 簡稱CXMS或XL-MS)。CXMS利用化學交聯劑將蛋白質或蛋白質複合體中空間距離足夠接近的兩個氨基酸通過共價鍵連接起來,酶切成肽段後用質譜鑒定出交聯位點,從而獲取低分辨度結構信息,幫助推斷蛋白質在三維空間的折疊狀態以及蛋白-蛋白相互作用的大致區域。相比于晶體和冷凍電鏡技術, CXMS對樣品量和樣品純度要求低,可捕獲蛋白質在溶液中的動態,並且具有簡單、快速等優點。因此,CXMS在過去十年中得到了廣泛應用,常常助力解析大型蛋白質複合體的精細結構,以及尋找蛋白與蛋白之間直接相互作用的區域。作爲先行者和推動者,董夢秋實驗室與計算科學、有機化學和蛋白質科學等領域的研究團隊長期密切合作,全方位發展交聯質譜技術,包括開發軟件 (Yang B, Nat Meth 2012; Lu S, Nat Meth 2015)、交聯劑 (Tan D, eLife 2016; Zhang X, Anal Chem 2018)、新的方法流程和應用 (Lu S, Nat Meth 2015; Gong Z, Biophys Rep 2015; Ding YH, Anal Chem 2016; Ding YH, J Biol Chem 2017)。


              當前交聯質譜技術的一個明顯局限是過分依賴氨基特異性的NHS酯交聯劑。此類交聯劑主要靶向賴氨酸,得到的結構信息有限,對于缺少賴氨酸的蛋白或蛋白區段,這個缺陷尤其明顯。因此,開發針對其他類型氨基酸的新型交聯劑成爲亟待解決的問題。


              爲了得到更豐富的結構信息,董夢秋實驗室與北京大學雷曉光實驗室合作開發了靶向精氨酸的交聯劑。該系列交聯劑在含有1-3個單體單元的聚乙二醇兩端連接芳香基取代的乙二醛 (aromatic glyoxal),稱爲 ArGO1-3。ArGO可以共價連接兩個精氨酸的側鏈胍基,具有良好的選擇性,彌補了氨基交聯劑的不足,但在不同蛋白樣品上的表現參差不齊。爲了改善性能和增加使用範圍,作者將ArGO交聯劑的一端換成了靶向賴氨酸的鄰苯二甲醛,並將其命名爲KArGO。KArGO使蛋白質表面更多的氨基酸殘基成爲靶點,增加了結構覆蓋度,在多個標准蛋白樣品上均表現出穩定可靠的交聯效果。作者進一步將KArGO應用在CNGP和UtpA等蛋白複合物的結構鑒定中,結果表明KArGO彌補了已有賴氨酸交聯劑的不足,提供了豐富的互補結構信息。


              圖 1. KArGO 的化學式和交聯反應


              CXMS的另一個關鍵環節是質譜數據分析。現有的交聯肽段鑒定軟件多達幾十種。相同數據用不同軟件分析得到的結果不盡相同,甚至差異巨大,因此交聯質譜領域迫切需要一套客觀、實用的軟件評測方案。在7月30號發表的pLink 2文章中,董夢秋實驗室協助中科院計算所賀思敏研究員領導的pFind團隊建立了全面的評測體系,並對十種主流軟件進行了評測和比較,其中包括2012年雙方合作開發的pLink 1軟件 (Yang B, Nat Meth 2012) 及其升級換代版pLink 2。pLink 2整合了pLink 1和蛋白質二硫鍵鑒定軟件pLink-SS (Lu S, Nat Meth 2015) 的所有功能,從內核算法到圖形界面都煥然一新。在模擬數據集、合成肽段數據集、15N標記數據集和陷阱庫方法等四種系統性評測實驗中,pLink 2和pLink 1的靈敏度和准確度都位居前兩名,遠超其他軟件。以模擬數據集(譜圖幾近完美)測試結果爲例,pLink 1 和 pLink 2在5%假發現率條件下的靈敏度和准確度分別達到和超過99.8%。pLink 2還有非常明顯的速度優勢;在變化交聯形式、數據規模和蛋白序列庫規模的20組評測中,pLink 2比pLink 1平均快40倍,比靈敏度和准確度位居第三的Kojak軟件平均快3倍。從2018年元旦免費公開發布到文章發表的一年多時間裏,pLink 2軟件已經擁有1000多名用戶。世界七大洲中,除南極洲外,都有pLink 2用戶。


              董夢秋實驗室2015級PTN博士生曹勇在兩篇文章中都是共同第一作者。精氨酸特異性交聯劑文章的共同第一作者還有雷曉光實驗室的英國籍博士後Alexander X. Jones以及博士生唐毓良,通訊作者是雷曉光博士和董夢秋博士,其他作者還有王建華、丁曰和、譚惠、陳鎮霖、方潤乾、尹吉澧、陳榮昌、朱星、佘楊、黃牛、邵峰、葉克窮和孫瑞祥。pLink 2文章的共同第一作者還有pFind團隊的博士生陳鎮霖和已經畢業的碩士生孟佳明,通訊作者是董夢秋和賀思敏博士,其他作者還有尹吉澧、方潤乾、樊盛博、劉超、曾文峰、丁曰和、譚丹、邬龍、周文婧、遲浩、孫瑞祥。兩項研究都得到了國家自然科學基金委、科技部、中科院和北京市政府的資助。


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